جدول 1-1 : اهداف بهینه سازی فرآوردهای گیاهی

اهداف

سودمندی

 

ویروس‏ها

حشرات علف کش امراض

بهینه کردن حاصلخیزی و کاهش زیان های ناشی از عوامل زیستی.

مقاومت در برابر

 

 

PH

شوری سرما خشکسالی

امکان رشد در شرایط فیزکی که اکنون مناسب نیستند.

تحمل

 

کاهش در حضور نور

افزایش کارای تبدیل انرژی.

تثبیت ازت

ایجاد امکان تثبیت ازت اتمسفر در گونه‏های بیشتری از گیاهان

ارزش تغذیه ای

بهینه سازی ارزش تغذیه ای پروتئین های ذخیره ای با مهندسی پروتئین.

خواص انبارداری

افزایش عمر انبار داری میوه جات و سبزی جات.

نیاز مصرف کننده

تولید میوه جات وسبزی جاتی که از نظر رنگ، شکل، اندازه و مانند اینها بازار پسند تر باشد.

 

 

1-2-        مروری بر وضعیت و روشهای تولید گیاهان تراریخته

امروزه از روشهای انتقال ژن (Transformation) به عنوان شیوه ای رایج برای ایجاد گیاهان دارای صفات ژنتیکی مطلوب، استفاده می گردد. توسط این روش ها، بشر توانسته است مدت زمان لازم برای تولید یک واریته جدید را خیلی کوتاه سازد. انتقال هدایت شده ژن مطلوب از یک موجود زنده به موجود دیگر و تلفیق و بیان پایدار آن ژن در ژنوم موجود پذیرنده را ترانسفورماسیون ژنتیکی گویند. ژن منتقل شده را ترانسژن (Transgene) و موجودی را که پس از انتقال ژن به صورت موفقیت آمیز بدست می آید، تراریخته (Transgenic) می نامند.  پدیده انتقال ژن در طبیعت از طریق ساز و کارهای متفاوتی میان باکتری ها روی می دهد. دانشمندان در دهه 1950 تا 1960 موفق به کشف این سازوکار شدند و در دهه 1970 موفق به ایجاد روش های مصنوعی انتقال ژن گردیدند. روشهای انتقال ژن مبتنی بر دو روش انتقال توسط ناقل(Vector) و انتقال بصورت مستقیم می باشد. از مهمترین ناقلین جهت انتقال ژن می توان به پلاسمیدهای آگروباکتریوم و ویروسها اشاره نمود. مهمترین باکتری مورد استفاده Agrobacterium tumefasines است که در طبیعت موجب بیماری گال طوقه در گیاهان می گردد. این باکتری دارای پلاسمیدی حلقوی بوده که توانایی انتقال به سلولهای گیاه میزبان را دارد. این پلاسمید می تواند همراه خود ژنهای خارجی دیگر موجودات را به گیاهان انتقال دهد. از ناقلین ویروسی می توان به ویروس موزاییک گل کلم، ویروس کرلی تاپ و ویروس موزاییک توتون اشاره نمود. از مهمترین روشهای انتقال مستقیم ژن می توان به نفوذدهی الکتریکی، ریزتزریقی DNA، درشت تزریقی و تفنگ ژنی (Gene gun) اشاره نمود.

 

1-3-        مراحل تولید یک گیاه تراریخته

انتقال ژن همانطور که ساده است سود کاربردی هم دارد. که قادر به مطالعه ساختار و عملکرد ژنهای جدا شده از طریق توصیف ، معرفی دوباره و آنالیز توالی آنها در گیاهان تراریخته ، لاین‏های سلول یا حتی جمعیت سلول. علاوه‏براین مخصوصا انتقال ژن‏های هیبرید طراحی شده به ژنوم گیاه تنوع‏های زیادی با ویژگی مورد نظر ایجاد می‏شود.

انتقال ژن در گیاهان می‏تواند از طریق روشهای جنسی و غیر جنسی انجام شود. که روشهای غیر تخصصی شامل:

الف) روش غیر تخصصی انتقال ژن : بوسیله تکنیک‏های پروتوپلاست

ب) روش تخصصی انتقال ژن : در حیوانات، انتقال ژن با استفاده از تخم و سلول‏های ساقه کشت شده

1-5- کلون کردن ژن مورد نظر

 کلون کردن یک ژن خاص مهمترین مرحله  در مهندسی ژنتیک است. هدف اصلی کلون کردن ژن،  انتقال ژن مورد نظر  از داخل یک ژنوم بزرگ و پیچیده به داخل یک حامل ساده و کوچک و تکثیر آن است. توانای کلون کردن ژن در E.coli  به چندین عمل بستگی دارد. DNA هدف و DNA وکتور باید با آنزیم برش دهنده مشابهی که معمولا انتهای چسبنده ایجاد می کنند بریده شوند. DNA های بریده شده با یکدیگر مخلوط شده و با آنزیم لایگیز به یکدیگر پیوند می خورند. وکتورهای نوترکیب برای تراریختی E.coli  مورد استفاده قرار گرفته و کلونی های که دارای مولکول وکتور باشند توسط محیط کشت آگار حاوی آنتی بیوتیک مورد انتخاب قرار میگرند. المثنی سازی را ترتیب داده و برای انتخاب (غیرفعال شدن بعلت وارد شدنE.coli ) یک محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک دوم مورد استفاده قرار می گیرد. سپس کلونی های نوترکیب حاوی ژن های مطلوب را جدا کرد.

کلون کردن ژن را می توان به مراحل زیر تقسیم کرد:

1-5-1- جداسازی و قطعه قطعه کردن منبع DNA

اولین گام در تولید DNA نوترکیب جدا کردن DNA سلول دهنده و سلول ناقل است. برای جدا کردن ژنهای خاص به ندرت می‏توان از ژنوم کامل یک موجود به طور مستقیم استفاده کرد و مناسبتر خواهد بود که ما ژنوم را قطعه قطعه کرده و به طور مجزا دنبال ژن مورد نظر خود بگردیم.  منبع DNA ژنوم کامل یک موجود،DNA ساخته شده از روی RNA با استفاده از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس(cDNA) و یا حتی DNA مصنوعی ساخته شده در آزمایشگاه باشد. اگر منبع DNA ژنوم کامل یک موجود باشد، باید آنرا بوسیله یک آنزیم محدود الاثر برش داد و قطعات حاصله را برای کلون کردن بکار برد.

1-5-2-                      اتصال به یک حامل کلون:

 حاملهای کلون، قطعات ژنتیکی کوچکی هستند که بطور مستقل توانای همانند سازی و تکثیر دارند. حاملهای کلون طوری طراحی میشوند که دارای محل برش بوسیله آنزیم های محدودالاثر باشند، ولی این محل اثر نباید در محل همانند سازی این حاملها باشد. شکل زیر مراحل جداسازی وکتور و انتقال ژن را نشان می دهد.

شکل 1 : مراحل جداسازی وکتور و انتقال ژن

 

 

1-5-3-                     ورود حامل به داخل میزبان:

DNA نوترکیب (حامل + قطعه DNA خارجی) حاصل به روشهای مختلف وارد باکتری یا میزبان مورد نظر می شود. برای مثال باکتریوفاژ را از طریق آلوده کردن و پلاسمید را از طریق ترانسفورماسیون وارد باکتری ها می کنند.

شکل زیر نحوه وارد شدن پلاسمید به درون سلول باکتریای را نشان می دهد.

شکل 2: وارد شدن پلاسمید به درون سلول باکتریای

1-5-4-  شناسای و جداسازی کلون ژن مورد نطر:

این مرحله شامل جداسازی میزبانهای میشود که ژن مورد نظر بوسیله حامل وارد آنها شده و به نحو مؤثر بیان میشود. این کار بر اساس خصوصیات ژن مورد انجام می‏گیرد‏. شاخصهای انتخابی موجود بر روی حاملها را می‏توان به چند گروه تقسیم کرد:

الف) مقاومت به آنتی‏بیوتیک‏ها : مقاومت به آنتی‏بیوتیک‏ها معمولا یا بوسیله آنزیم‏های ایجاد می‏شود که باعث غیرفعال شدن آنتی‏بیتیک‏ها می‏شوند و یا با سنتز پروتئین‏های است که به روش‏های مختلف باعث ممانعت از اثر آنتی‏بیتیک‏ها می‏شوند.

ب) توانای مصرف مواد: در مورد توانای مصرف مواد آشناترین و پر مصرف‏ترین شاخص مورد استفاده، β_‏گالاکتوزیداز می باشد. این ژن آنزیم β_‏گالاکتوزیداز را کد می‏کند که پیوند β_‏گالاکتوزیداز بین گالاکتوز و گلوکز را می‏شکند.

ج) نیازهای متابولیسمی: نیازهای متابولیسمی طیف وسیعی از مواد مختلف را شامل می‏شود. برای این کار از سوشهای خاصی از میزبان استفاده می‏شود که توانایی ساختن یک ماده متابولیسمی ضروری(معمولا اسید‏های‏آمینه) را از دست داده‏اند، در نتیجه این باکتریها بر روی محیطهای بدون این ماده متابولیسمی رشد نخواهند کرد.

شکل 3 : شناسای و جداسازی کلون ژن مورد نطر

 

1-5-5-  تولید تعداد زیاد سلولها و یا باکتریهای حاوی ژن مورد نظر: این کار به منظور جداسازی و بررسی ژن مورد نظر انجام میگرد.

 

1-5-6-  انتقال پلاسمید حاوی ژن مورد نظر از میزبان به آگروباکتریوم یا دیگر ناقل‏های دیگر

 

1-5-7-  وارد کردن DNA کلون شده از آگرو باکتریوم به یاخته گیاهی:وارد کردن DNA کلون شده به یاخته گیاهی به صورت امری روزمره در سراسر جهان در آمده است. روشهای زیادی برای این کار وجود دارد که دربر دارنده روشهای فیزیکی مانند ریزتزیقی و یا انتقال به روش زیست شناختی است. شکل زیر بیان کننده همین موضوع است.

 

شکل 4 : وارد کردن DNA کلون شده از آگرو باکتریوم به سلول گیاهی

 

1-5-8-                     استخراج DNA ژنومی و آنالیز PCR:

DNA را بافت گیاه بازیابی شده استخراج کرده و آنالیز PCR با آغازگرهای اختصاصی صورت میگیرد و گیاهان دارای ژن مورد نظر شناسای می‏شوند.

 

1-5-9-                      استخراج پروتئین و آنالیز آن:  

پروتئن را بافت گیاه تراریخته استخراج کرده و آن با روشهای مثل ELISA آنالیز کرده و به این ترتیب بیان ژن در گیاه تراریخت  مورد نظر تایید و یا رد می‏شود.

 

 

 

منابع

  1. امتیازی، گیتی. (1386). مبانی زیست مولکولی و مهندسی ژنتیک. چاپ اول. اصفهان. مانی.
  2. نیکول، دسموند،اس،تی. (1378). پیش درامدی بر مهنسی ژنتیک. ترجمه: دکتر محمود امین لاری. شیراز: مرکز نشر دانشگاه شیراز.
  3. مورل،جی.سی. و رابرت.ال.ام. (1372). آشنای با مهندسی ژنتیک. ترجمه: سید عباس شجاع‏الساداتی و مصطفی مطلبی. تهران:انشارات فردابه.
  4. آساد، محمد تقی. (1386). مبانی ژنتیک. ویرایش دوم. تهران. چهر.

 

 

1.    Brown, T.A.(2010). Gene cloning and DNA analysis. 6th ed. by raphicraft Limited, Hong Kong.

2.    Joshi, P.(2000). Genetic Engeneerng and its Applications. Idia: AGROBIOS.

 

 

اینترنت:

http://www.sid.ir

http://www.skanrc.ir

http://www.aftab.ir

http://www.isaaa.org

www.berenge.com

http://www.msrt.ir

 

+ نوشته شده در  یکشنبه 1389/12/08ساعت 23:6  توسط ابوذر اسدی  |