|
جدول 1-1 : اهداف بهینه سازی فرآوردهای گیاهی
1-2- مروری بر وضعیت و روشهای تولید گیاهان تراریخته امروزه از روشهای انتقال ژن (Transformation) به عنوان شیوه ای رایج برای ایجاد گیاهان دارای صفات ژنتیکی مطلوب، استفاده می گردد. توسط این روش ها، بشر توانسته است مدت زمان لازم برای تولید یک واریته جدید را خیلی کوتاه سازد. انتقال هدایت شده ژن مطلوب از یک موجود زنده به موجود دیگر و تلفیق و بیان پایدار آن ژن در ژنوم موجود پذیرنده را ترانسفورماسیون ژنتیکی گویند. ژن منتقل شده را ترانسژن (Transgene) و موجودی را که پس از انتقال ژن به صورت موفقیت آمیز بدست می آید، تراریخته (Transgenic) می نامند. پدیده انتقال ژن در طبیعت از طریق ساز و کارهای متفاوتی میان باکتری ها روی می دهد. دانشمندان در دهه 1950 تا 1960 موفق به کشف این سازوکار شدند و در دهه 1970 موفق به ایجاد روش های مصنوعی انتقال ژن گردیدند. روشهای انتقال ژن مبتنی بر دو روش انتقال توسط ناقل(Vector) و انتقال بصورت مستقیم می باشد. از مهمترین ناقلین جهت انتقال ژن می توان به پلاسمیدهای آگروباکتریوم و ویروسها اشاره نمود. مهمترین باکتری مورد استفاده Agrobacterium tumefasines است که در طبیعت موجب بیماری گال طوقه در گیاهان می گردد. این باکتری دارای پلاسمیدی حلقوی بوده که توانایی انتقال به سلولهای گیاه میزبان را دارد. این پلاسمید می تواند همراه خود ژنهای خارجی دیگر موجودات را به گیاهان انتقال دهد. از ناقلین ویروسی می توان به ویروس موزاییک گل کلم، ویروس کرلی تاپ و ویروس موزاییک توتون اشاره نمود. از مهمترین روشهای انتقال مستقیم ژن می توان به نفوذدهی الکتریکی، ریزتزریقی DNA، درشت تزریقی و تفنگ ژنی (Gene gun) اشاره نمود.
1-3- مراحل تولید یک گیاه تراریختهانتقال ژن همانطور که ساده است سود کاربردی هم دارد. که قادر به مطالعه ساختار و عملکرد ژنهای جدا شده از طریق توصیف ، معرفی دوباره و آنالیز توالی آنها در گیاهان تراریخته ، لاینهای سلول یا حتی جمعیت سلول. علاوهبراین مخصوصا انتقال ژنهای هیبرید طراحی شده به ژنوم گیاه تنوعهای زیادی با ویژگی مورد نظر ایجاد میشود. انتقال ژن در گیاهان میتواند از طریق روشهای جنسی و غیر جنسی انجام شود. که روشهای غیر تخصصی شامل: الف) روش غیر تخصصی انتقال ژن : بوسیله تکنیکهای پروتوپلاست ب) روش تخصصی انتقال ژن : در حیوانات، انتقال ژن با استفاده از تخم و سلولهای ساقه کشت شده 1-5- کلون کردن ژن مورد نظرکلون کردن یک ژن خاص مهمترین مرحله در مهندسی ژنتیک است. هدف اصلی کلون کردن ژن، انتقال ژن مورد نظر از داخل یک ژنوم بزرگ و پیچیده به داخل یک حامل ساده و کوچک و تکثیر آن است. توانای کلون کردن ژن در E.coli به چندین عمل بستگی دارد. DNA هدف و DNA وکتور باید با آنزیم برش دهنده مشابهی که معمولا انتهای چسبنده ایجاد می کنند بریده شوند. DNA های بریده شده با یکدیگر مخلوط شده و با آنزیم لایگیز به یکدیگر پیوند می خورند. وکتورهای نوترکیب برای تراریختی E.coli مورد استفاده قرار گرفته و کلونی های که دارای مولکول وکتور باشند توسط محیط کشت آگار حاوی آنتی بیوتیک مورد انتخاب قرار میگرند. المثنی سازی را ترتیب داده و برای انتخاب (غیرفعال شدن بعلت وارد شدنE.coli ) یک محیط کشت حاوی آنتی بیوتیک دوم مورد استفاده قرار می گیرد. سپس کلونی های نوترکیب حاوی ژن های مطلوب را جدا کرد. کلون کردن ژن را می توان به مراحل زیر تقسیم کرد: 1-5-1- جداسازی و قطعه قطعه کردن منبع DNA اولین گام در تولید DNA نوترکیب جدا کردن DNA سلول دهنده و سلول ناقل است. برای جدا کردن ژنهای خاص به ندرت میتوان از ژنوم کامل یک موجود به طور مستقیم استفاده کرد و مناسبتر خواهد بود که ما ژنوم را قطعه قطعه کرده و به طور مجزا دنبال ژن مورد نظر خود بگردیم. منبع DNA ژنوم کامل یک موجود،DNA ساخته شده از روی RNA با استفاده از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس(cDNA) و یا حتی DNA مصنوعی ساخته شده در آزمایشگاه باشد. اگر منبع DNA ژنوم کامل یک موجود باشد، باید آنرا بوسیله یک آنزیم محدود الاثر برش داد و قطعات حاصله را برای کلون کردن بکار برد. حاملهای کلون، قطعات ژنتیکی کوچکی هستند که بطور
مستقل توانای همانند سازی و تکثیر دارند. حاملهای کلون طوری طراحی میشوند که دارای
محل برش بوسیله آنزیم های محدودالاثر باشند، ولی این محل اثر نباید در محل همانند
سازی این حاملها باشد. شکل زیر مراحل جداسازی وکتور و انتقال ژن را نشان می دهد. شکل 1 : مراحل جداسازی وکتور و انتقال ژن
1-5-3- ورود حامل به داخل میزبان: DNA نوترکیب (حامل + قطعه DNA خارجی) حاصل به روشهای مختلف وارد باکتری یا میزبان مورد نظر می شود. برای مثال باکتریوفاژ را از طریق آلوده کردن و پلاسمید را از طریق ترانسفورماسیون وارد باکتری ها می کنند. شکل
زیر نحوه وارد شدن پلاسمید به درون سلول باکتریای را نشان می دهد. شکل 2: وارد شدن پلاسمید به درون سلول باکتریای
1-5-4- شناسای و جداسازی کلون ژن مورد نطر: این مرحله شامل جداسازی میزبانهای میشود که ژن مورد نظر بوسیله حامل وارد آنها شده و به نحو مؤثر بیان میشود. این کار بر اساس خصوصیات ژن مورد انجام میگیرد. شاخصهای انتخابی موجود بر روی حاملها را میتوان به چند گروه تقسیم کرد: الف) مقاومت به آنتیبیوتیکها : مقاومت به آنتیبیوتیکها معمولا یا بوسیله آنزیمهای ایجاد میشود که باعث غیرفعال شدن آنتیبیتیکها میشوند و یا با سنتز پروتئینهای است که به روشهای مختلف باعث ممانعت از اثر آنتیبیتیکها میشوند. ب) توانای مصرف مواد: در مورد توانای مصرف مواد آشناترین و پر مصرفترین شاخص مورد استفاده، β_گالاکتوزیداز می باشد. این ژن آنزیم β_گالاکتوزیداز را کد میکند که پیوند β_گالاکتوزیداز بین گالاکتوز و گلوکز را میشکند. ج) نیازهای متابولیسمی: نیازهای متابولیسمی طیف وسیعی از مواد مختلف را شامل میشود. برای این کار از سوشهای خاصی از میزبان استفاده میشود که توانایی ساختن یک ماده متابولیسمی ضروری(معمولا اسیدهایآمینه) را از دست دادهاند، در نتیجه این باکتریها بر روی محیطهای بدون این ماده متابولیسمی رشد نخواهند کرد. شکل 3 : شناسای و جداسازی کلون ژن مورد نطر
1-5-5- تولید تعداد زیاد سلولها و یا باکتریهای حاوی ژن مورد نظر: این کار به منظور جداسازی و بررسی ژن مورد نظر انجام میگرد.
1-5-6- انتقال پلاسمید حاوی ژن مورد نظر از میزبان به آگروباکتریوم یا دیگر ناقلهای دیگر
1-5-7- وارد کردن DNA کلون شده از آگرو باکتریوم به یاخته گیاهی:وارد کردن DNA کلون شده به یاخته گیاهی به صورت امری روزمره در سراسر جهان در آمده است. روشهای زیادی برای این کار وجود دارد که دربر دارنده روشهای فیزیکی مانند ریزتزیقی و یا انتقال به روش زیست شناختی است. شکل زیر بیان کننده همین موضوع است.
شکل 4 : وارد کردن DNA کلون شده از آگرو باکتریوم به سلول گیاهی
1-5-8- استخراج DNA ژنومی و آنالیز PCR: DNA را بافت گیاه بازیابی شده استخراج کرده و آنالیز PCR با آغازگرهای اختصاصی صورت میگیرد و گیاهان دارای ژن مورد نظر شناسای میشوند.
1-5-9- استخراج پروتئین و آنالیز آن: پروتئن را بافت گیاه تراریخته استخراج کرده و آن با روشهای مثل ELISA آنالیز کرده و به این ترتیب بیان ژن در گیاه تراریخت مورد نظر تایید و یا رد میشود.
منابع
1. Brown, T.A.(2010). Gene cloning and DNA analysis. 6th ed. by raphicraft Limited, Hong Kong. 2. Joshi, P.(2000). Genetic Engeneerng and its Applications. Idia: AGROBIOS.
اینترنت: http://www.isaaa.org http://www.msrt.ir
+ نوشته شده در یکشنبه ۱۳۸۹/۱۲/۰۸ساعت 23:6 توسط ابوذر اسدی
|
|
درباره وبلاگ 
|
||||||||||||||||||||||||||||||
